Microscopische fotografie
Marc Brouwer

Fotograferen op microscopisch niveau kan hele bijzondere foto's opleveren. Door de extreme vergroting is het mogelijk om details vast te leggen die voor het blote oog niet zichtbaar zijn. Er zijn talloze unieke patronen en structuren te ontdekken en ook kunnen insecten en geleedpotigen met veel meer detail vastgelegd worden dan bijvoorbeeld met een macrolens. Op deze website wil ik niet alleen foto's laten zien, maar ook een beeld geven van hoe zulke foto's gemaakt kunnen worden en wat daarbij nodig is.

Infinity objectives zijn in heel veel soorten te krijgen. In prijs, kwaliteit, belichtingstechniek, vergroting en scherpstelafstand kunnen ze enorm verschillen. De vergroting die nodig is, is sterk afhankelijk van wat je wilt fotograferen. Gaat het om net dat stapje verder dan een macrolens dan is een 5x vergroting al genoeg. Om echt een stuk meer te vergroten is een vergroting van 10x of 20x wat interessanter. Hierbij is het mogelijk om veel gedetailleerde te fotograferen. 50x of meer is ook mogelijk maar maakt het fotograferen niet makkelijker. Hoe extremer de vergroting, des de minder er scherp is. De daadwerkelijke vergroting is niet alleen afhankelijk van het objectief, maar ook hoe deze bevestigd wordt op de camera.

Scherpstelafstand is belangrijk bij het fotograferen van wat grotere en diepere objecten. In de meeste gevallen is de scherpstelafstand maar een paar millimeter waardoor het onmogelijk is om bijvoorbeeld het binnenste van een bloem te fotograferen zonder deze eerst uit elkaar te halen. Ook voor insecten en andere grotere objecten is een scherpstelafstand van een paar millimeter niet voldoende. Gelukkig zijn er ook objectieve met een lange werkafstand, oftewel een grotere scherpstelafstand. Afhankelijk van de vergroting kan dit gerust een paar centimeter zijn. Hierdoor kunnen de grotere objecten goed gefotografeerd worden zonder risico van beschadigingen.

Er zijn veel belichtingstechnieken binnen microscopie en voor verschillende technieken zijn verschillende microscopische objectieven nodig. Bij het uitzoeken van een microscopisch objectief is het dus ook van belang dat deze geschikt is voor de gewenste belichting. Zo is het mogelijk om door middel van elektronen te belichten. Daar zijn speciale objectieven voor en zijn overbodig als alleen het zichtbare licht spectrum gebruikt wordt. Bij belichting met het zichtbare licht spectrum, moet het objectief geschikt zijn voor brightfield illumination. In het geval van brightfield illumination zijn er ook nog verschillende technieken, waarvan de meest bekende technieken reflecterend en doorschijnend zijn en kunnen gecombineerd worden. Bij reflecterend is de lichtbron boven het object, dat wil zeggen, aan dezelfde kant als de camera. Het licht schijnt op het object en komt dus als reflecterend licht door de lens. In het geval van doorschijnend belichten is de lichtbron achter het object, dus tegenover de camera en schijnt door het object heen en door naar de lens. Reflecterend is eigenlijk altijd mogelijk, maar doorschijnend niet, omdat er niet altijd licht door een object heen gaat. Om de achtergrond zwart te krijgen bij reflecterend licht moet het object op een objectglaasje liggen en alles onder het glaasje afgeschermd worden zodat daar geen licht komt.

Microscopische objectieven hebben slechts een heel klein scherptevlak (het gaat om een aantal micron...). Om een object als nog van voor tot achter scherp te krijgen moet het object in laagjes gefotografeerd worden. Elke laagje heeft steeds een ander klein deel van het object scherp. Al deze laagjes worden later samengevoegd tot een scherp geheel. Deze techniek heet focus stacking, meer over deze techniek leg ik verderop uit. Eerst het fotograferen van al deze laagjes.

Afhankelijk van het formaat van het object dat gefotografeerd wordt, kan het zijn dat er een aantal honderd tot enkele duizenden foto's nodig zijn om al de eerder genoemde laagjes te fotograferen. De verschuiving in scherptevlak tussen twee foto's is veelal een aantal micron. Het grote aantal foto's en de extreem kleine verschuiving is handmatig niet meer te doen. Hiervoor is een geautomatiseerde macro rail nodig. Deze is in staat om te camera steeds die paar micron te verplaatsen en stuurt de camera aan om foto's te maken. Geautomatiseerde macro rails zijn te koop, maar het is ook mogelijk om ze zelf te maken. De macro rail die ik zelf gemaakt heb is opgebouwd uit onderdelen van Makeblock, met een microcontroller gebaseerd op de Arduino UNO.

De combinatie van de stappenmotor en de schroefdraadstang bepalen hoe nauwkeurig de camera verschoven kan worden. De schroefdraadstang bepaalde de afstand per rotatie van 360°, dus de afstand door de schroef een keer helemaal rond te draaien. Voor mijn schroefdraadstang is dit 2mm per 360°. De stapgrote in graden van de stappenmotor bepaald hoeveel de schroefdraadstang rondgedraaid kan worden. Mijn stappenmotor heeft een stapgrote van 1.8° per volledige stap, maar het is mogelijk om als minimum 1/16e van deze stap per keer de draaien. Hierdoor is de minimale rotatie van de stappenmotor 1.8°/16 = 0.1125°. Voor een volledige rotatie van 360°, met een stapgrote van 0.1125°, zijn er dus 360°/0.1125° = 3200 stappen nodig om 360° te roteren. De verschuiving per stap is nu 2mm/3200 = 0.000625mm = 0.625µm. Dus de nauwkeurigheid van mijn macro rail is 0.625µm per stap.

Het proces van de macro rail is verder heel eenvoudig. Vanaf het startpunt tot het eindpunt is het herhaaldelijk de camera verschuiven, LED lampen aanzetten, foto maken, LED lampen uitzetten en weer opnieuw. Na het verschuiven van de camera kan het handig zijn om even te wachten voor het maken van de foto om trillingen te voorkomen. Het aan en uitzetten van de LED lampen is niet altijd nodig.

Focus stacking is een techniek om meer scherp te krijgen dan met een foto mogelijk is. Dit wordt gedaan door meerder foto's te combineren. Elke foto heeft een klein deel van een object scherp en door al deze foto's samen te voegen is het mogelijk om een scherp geheel te krijgen. Hoe deze foto's gemaakt kunnen worden staat beschreven onder het kopje macro rail/opstelling. Het beste programma dat ik tot nu toe tegengekomen ben is Zerene Stacker. Het programma kent verschillende methoden om te stacken en lijnt foto's uit op het moment dat ze iets verschoven zijn. Alleen bij diepe stacks van duizend foto's of meer is er een zichtbaar verlies in scherpte. In de toekomst wil ik zelf stacking software schrijven die dit beter kan, hier ben ik wel aan begonnen, maar gezien de hoeveelheid tijd dat het vraagt kan dit nog even duren. Belangrijk bij focus stacking is wel dat het object zelf niet beweegt aangezien dit niet gecorrigeerd kan worden. Ook moeten de scherpe delen in elkaar overlopen om onscherpe delen te voorkomen.

Stitching kan gezien worden als een soort panorama. Als een object niet volledig in beeld past moet het in delen gefotografeerd worden. Elk deel is hier een foto waarbij eerst focus stacking toegepast is om het object van voor tot achter scherp te krijgen. Nadat alle delen gestackt zijn kunnen ze als een puzzel samengevoegd worden tot een foto, dit samenvoegen heet stitching. Als er genoeg overlap is kan een programma als Photoshop dit door middel van de panorama functie samenvoegen. Lukt dit niet dan moet het handmatig gedaan worden. Bij het handmatig uitlijnen is het vaak makkelijk om in lagen te werken en een de bovenste laag half doorzichtig te maken. Vervolgens kunnen de lagen over elkaar gelegd worden zodat er een minimaal verschil is. Daarna is het met een masker (of door te gummen) mogelijk om het harde verloop tussen twee lagen weg te krijgen en de lagen vloeiend in elkaar over te laten lopen.

Één van mijn meest bijzondere projecten was het fotograferen van hele kleine beestjes voor op de nieuwe verpakkingen van producten van Koppert. De opdracht was om deze kleine beestjes vast te leggen met microscopische details. Om de foto's extra aantrekkelijk (maar daardoor ook extra moeilijk) te maken, werd er bij sommige foto's gevraagd om te zorgen voor een mooi kleurverloop in de achtergrond.

Sommige beestjes waren enkele millimeters groot, anderen slechts een fractatie daarvan. De En-Strip, Ercal, Aphipar-M en Enermix zijn miniscule vliegjes. De Swirski-Mite en Thripex zijn roofmijten. Zowel de vliegjes als de roofmijten waren erg beweeglijk waardoor het een hele kunst was om ze goed vast te leggen. Met een vanuit de hand bediende camera met microscopisch objectief is het, zelfs als het beestje stil zit, al heel lastig om het beestje überhaupt in beeld te krijgen. Hierbij moest uiteraard ook het scherptepunt goed liggen, maar daarnaast ook de compositie mooi zijn en het achtergrond naar wens zijn. Gelukkig had ik een hele goede assistente die mij daarbij kon helpen want alleen is een dergelijke klus onbegonnen werk.

Al deze beestjes zijn bedoeld als natuurlijke bestrijders van ongedierte en worden o.a. gebruikt in de glastuinbouw. Als je daar meer over wilt weten kan je uiteraard het beste even naar de website van Koppert gaan om daar een kijkje te nemen. Daar kan je ook nog meer foto's tegenkomen die ik gemaakt heb. Hieronder is slechts een kleine selectie te zien.